集中空调送风中嗜肺军团菌检验方法（规范性附录G）

 

 

　　本附录规定了用液体冲冲击法测定集中空调系统送风中的嗜肺军团菌。

 

　　下列术语和定义适用于本方法。

　　G.2.1嗜肺军团菌  legionella pneumophila

　　样品经培养在GVPG琼脂平板上生成典型菌落，并在BCYE琼脂平板上生长而在L-半光氨酸缺失的BCYE琼脂平板不生长，进一步经生化实验和血清学实验鉴定确认的菌落。

 

　　G.3.1  微生物气溶胶浓缩器：采样流量≥100 L/min.，对于直径3.0μm以上粒子其捕集效率≥80%或浓缩比≥8。

　　G.3.2 液体冲击式微生物气溶胶采样器：采样流量7 L/min-15 L/min.，对于0.5μm粒子的捕集效率≥90%。

　　G.3.3 离心管：容积50 mL。

　　G.3.4 平皿：Φ90 mm。

　　G.3.5  CO2培养箱：35℃～37℃。

　　G.3.6  紫外灯：波长360 nm±2 nm。

　　G.3.7  涡旋振荡器。

　　G.3.8 普通光学显微镜、荧光显微镜。

　　G.3.9 水浴箱。

 

　　G.4.1  采样吸收液1-GVPC液体培养基

　　G.4.1.1 GVPC添加剂成分：

　　多粘菌素B硫酸盐    10 mg

　　万古霉素    0.5 mg

　　放线菌酮    80 mg

　　G.4.1.2   BCYE添加剂成分：

　　α一酮戊二酸    1．0 g

　　N-2酰胺基一2胺基乙烷磺酸（ACES）  10.0 g 

　　氢氧化钾    2. 88 g

　　L-半胱氨酸盐酸盐   0.4 g

　　焦磷酸铁    0. 25 g

　　G.4.1.3  吸收液成分：

　　活性碳    2g

　　酵母浸出粉    10 g

　　GVPC添加剂    见G.4.1.1

　　BCYE添加剂    见G.4.1.2

　　蒸馏水    1000 mL

　　G.4.1.4制法：将活性碳、酵母浸出粉加水至1 000 mL，121℃下高压灭菌15 min，加入GVPC添加剂（G．4.1.1）和BCYE添加剂（G.4.1.2），分装于灭菌后的离心管（G.3.3）中备用。

　　G.4.2  采样吸收液2-酵母提取液

　　G.4.2.1  吸收液成分：

　　酵母浸出粉    12 g

　　蒸馏水    1 000 mL

　　G.4.2.2制法：将酵母浸出粉加水至1 000 mL，121℃下高压灭菌15 min，分装于灭菌后的离心管（G.3.3）中备用。

　　G.4.3  盐酸氯化钾溶液[c（HCI·KCI） =0. 01 mol/L]

　　G.4.3.1成分：

　　盐酸（0.2 mol/L）    3.9 mlL

　　氯化钾（0.2 mol/L）    20 mL

　　G.4.3.2制法：将上述成分混合，用1mol/L）氢氧化钠调整pH=2.2±0.2，121℃下高压灭菌15 min备用。

　　G.4.4  其他试剂

　　G.4.4.1 GVPC琼脂平板。

　　G.4.4.2   BCYE琼脂平板。

　　G.4.4.3   BCYE-CYE琼脂平板。

　　G.4.4.4 革兰氏染色液。

　　G.4.4.5 马尿酸盐生化反应管。

　　G.4.4.6 军团菌分型血清试剂。

 

　　G.5.1  采样点：每套空调系统选择3个～5个送风口进行检测，每个风口设置1个测点，一般设在送风口下方15 cm～20 cm、水平方向向外50 cm～100 cm处。

　　G.5.2 将采样吸收液1（G.4.1）20 mL倒入微生物气溶胶采样器（G.3.2）中，然后用吸管加入矿物油1滴～2滴。

　　G.5.3 将微生物气溶胶浓缩器（G．3.1）与微生物气溶胶采样器（G.3.2）连接，按照微生物气溶胶浓缩器和微生物气溶胶采样器的流量要求调整主流量和浓缩流量。

　　G.5.4 按浓缩器和采样器说明书操作，每个气溶胶样品采集空气量1 m3～2 m3。 

　　G.5.5 将采样吸收液2（G．4.2）20  mL倒入微生物气溶胶采样器（（G．3.2）中，然后用吸管加入矿物油1滴～2滴；在相同采样点重复G.5.3-G.5.4步骤。

　　G.5.6 采集的样品不必冷冻，但要避光和防止受热，4 h内送实验室检验。

 

　　G.6.1  样品的酸处理：对采样后的吸收液1（G.4.1）和吸收液2（G.4.2）原液各取1 mL．分别加入盐酸氯化钾溶液（G.4.3）充分混合，调pH至2.2．静置15 min。

　　G.6.2 样品的接种：在酸处理后的2种样品（G.6.1）中分别加入1 mol/L氢氧化钾溶液，中和至pH为6.9，各取悬液0.2 mL～O.3 mL分别接种GVPC平板（G.4.4）。

　　G.6.3 样品的培养：将接种平板静置于浓度为5%、温度为35℃～37℃的CO2培养箱（G.3.5）中，孵育10 d。

　　G.6.4 菌落观察：从孵育第3天开始观察菌落。军团菌的菌落颜色多样，通常呈白色、灰色、蓝色或紫色，也能显深褐色、灰绿色、深红色；菌落整齐，表面光滑，呈典型毛玻璃状，在紫外灯下，部分菌落有荧光。

　　G.6.5 菌落验证：从平皿上挑取2个可疑菌落，接种BCYE琼脂平板（G.4.5）和L-半光氨酸缺失的BCYE琼脂平板（G．4.6），35℃～37℃培养2d，凡在BCYE琼脂平板上生长而在L-半光氨酸缺失的BCYE琼脂平板不生长的则为军团菌菌落。

　　G.6.6 菌型确定：应进行生化培养与血清学实验确定嗜肺军团菌。生化培养：氧化酶（-／弱+），硝酸盐还原（-），尿素酶（-），明胶液化（+）．水解马尿酸。血清学实验：用嗜肺军团菌诊断血清进行分型。

 

　　G.7.1 采样点测定结果：两种采样吸收液中至少有一种吸收液培养出嗜肺军团菌，即为该采样点嗜肺军团菌阳性。